如何选择显微镜上的相机
发布时间：2020-12-11
目前市场上有许许多多的显微镜可供选择，单就相机而言，它们的各种复杂参数就让人云里雾里。如何选择一款最适合的相机，也许你该听听专家的意见。成像技术的进步，以及配套工具的发展，正为我们呈现出一个五彩斑斓的生物学世界。如今，我们可以观察细胞网络，窥探细胞内部，并实时观察各种生物学过程。这一切，都离不开显微镜。
显微镜相机捕获了一个不为人知的微观世界，让我们对大自然的复杂精巧赞叹不已。目前市场上有许许多多的显微镜可供选择，单就相机而言，它们的各种复杂参数就让人云里雾里。如何选择一款最适合的相机，也许你该听听专家的意见。
专家认为：“第一个关键点是选择合适的光学组件，能够捕捉各种现象，然后是选择与之匹配的相机。如果物镜的光学分辨率低于你要观察的结构，那么任何相机都帮不上忙。”
通常人们会根据传感器的类型来选择相机。CMOS（互补金属氧化物半导体）和CCD（电荷耦合器件）是两种最常见的传感器。这两种传感器的光电转换原理相同，但是信号的读出过程不同。考虑到灵敏度、噪声和暗电流噪声等，人们总认为CCD会逐渐取代CMOS，而CMOS也被认为是一种经济的替代品。
不过，经过多年的发展，CMOS传感器似乎开始“咸鱼翻身”。据Andor公司显微镜产品专家Alan Mullan介绍，自2010年左右推出科学级CMOS（sCMOS）传感器以来，行间传输CCD传感器已不再那么受欢迎。他认为，sCMOS正取代CCD成为显微镜中的“全能王”。
我们也持有类似的观点。“目前，在高端显微镜中，sCMOS已成为最常用的解决方案。sCMOS的唯一缺点是缺乏长时间曝光的能力，因为它会对图像造成太大的噪声，”他说。CCD相机仍然是长时间曝光的首选。此外还有适用于最低光照条件的EMCCD（电子倍增CCD）。认为，EMCCD非常灵敏，可用来捕捉快速的生物现象。
如何选择相机？
根据传感器类型来选择相机是一种办法，但不是唯一的办法。Thorlabs Scientific Imaging公司的首席技术专家Ash Prabala认为，量子效率（QE）和读取噪声（Nr）是决定相机灵敏度的两个关键变量。因此，在选购时需要考虑信噪比（SNR）。
据Prabala介绍，在极低的光照条件（小于10个光子/像素）下，EMCCD提供最高的信噪比。随着光照水平的增加，sCMOS相机也是不错的选择，比如TPCO科学级CMOS相机。
Mullan认为：“相机列出了许多参数，而你很难确定哪些参数真正重要，以及它们对图像质量到底有没有影响。此外，一些关键的参数可能无法同时达到。”例如，调整读取噪声可能会影响速度。他认为最重要的三个参数是：灵敏度、分辨率和速度。
影响信噪比的因素——制冷与暗电流
由于暗电流（信噪比公式中的”D”）来源于材料中电子的热运动，所以芯片温度越高，暗电流越大；对于同一芯片，近似的规律是温度每下降10度，暗电流减小一半。
当前市场上的中高端科研相机的暗电流通常都很小，在1s以下曝光时间时，暗噪声相比于读出噪声通常可以忽略。但由于暗电流随曝光时间会积累，所以越是长曝光时间的应用，制冷就越重要。
在实际选型中，不同类型的相机对制冷的要求也不尽相同：
（1）对于EMCCD相机，像素尺寸通常较大（常见的为13-16μm），每个像素上产生的暗电流本就较多，而且EMCCD中的暗电流还会和信号一起被增益放大，所以用制冷压制EMCCD相机的暗电流产生尤其重要。因为这些原因，主流的EMCCD相机制冷温度都在-50℃以下。
（2）而对于sCMOS相机，不仅像素尺寸会较小一些（常见的为6.5μm），也没有额外的增益，所以对制冷的要求就相对低一点。
笔者在平时工作中，就曾经有过两个有趣的相关经历。第一个是刚接触科研相机时，看到许多诸如室温下10℃（-10℃ from ambient temperature）的相机，表示不可理解，觉得”就10度的制冷，这有啥用？”。第二个是滨松有一款面向产业客户的板级sCMOS相机C11440-62U，其制冷温度为室温上10℃（+10℃ from ambient temperature），刚看到参数的时候也是小小疑惑了一把。其实当年产生这样的疑惑，就是因为没有意识到如果相机没有制冷，实际的工作温度将远超室温这一点。
小结：对于当今的高端相机，只要有制冷，暗电流都很小。
在信号较弱的成像中，来自信号的散粒噪声较小；而暗电流的散粒噪声（即暗噪声）在当前的高端科研相机都是很低的，在曝光时间1s这个量级甚至更短的时候，暗噪声通常可以忽略；此时读出噪声（即信噪比公式中的”R”）就称为特别需要考量的因素了。
对于同样的芯片，读出噪声的大小与读出速度有关，无论对于CCD相机还是sCMOS相机，读出速度越快，读出噪声越高。而sCMOS相对于CCD的一个核心优势，就是高速读出时依然能够保持极低的读出噪声。
读出噪声的重要性也使得其和QE一起变成了相机被重点关注的两个参数。单纯考察两者中的一个优势并不能正确预测成像的信噪比。如图9所示，同样拍一个绿色荧光样品，QE较高的ORCA-Spark成像质量却不如ORCA-Flash 4.0 LT，就是因为ORCA-Flash 4.0 LT的读出噪声较低，综合考虑时ORCA-Flash 4.0 LT的信噪比更好。
小结：如果用于弱信号探测，相机的读出噪声对于总体的信噪比很重要。
另外，所有专家都提醒，如果没有用你自己的样品做过演示，千万不要买。这是确定哪款相机满足您需求的唯一方法。总是强调取舍，正所谓有得也有失。如果你现在无法确定相机的主要用途，那么可以选择全能型的sCMOS。
事实上，sCMOS总是被专家反复推荐。Mullan表示，无论是明场还是荧光成像，无论是单一还是混合成像，sCMOS也许都是最佳选择，比如PCO的Edge系列相机。
的终极建议是：任何高端相机都无法检测到低端显微镜所丢失的信息。从另一方面来说，若使用低端相机，那么搭配顶级物镜也没有意义。“平衡，这就是显微镜专家为帮助客户找到最佳解决方案而做的事情。”
sCMOS相机是如今的“全能型”相机。若需要在不同光照水平下使用显微镜，可考虑这个选项。记住，在极低光照条件下，EMCCD相机可能更适合。CCD相机仍然分为许多种，具体取决于您的参数。
对显微镜的相机而言，相机灵敏度可能是最重要的参数。共聚焦或光场显微镜等技术本身就是低光度，因此必须使用灵敏的相机。换句话说，明视场显微镜不需要同样的灵敏度。
灵敏度取决于信噪比（SNR），当然越高越好。为了获得最佳的信噪比，相机的量子效率（QE）要高，而读取噪声（Nr）要低。噪声取决于所需的曝光类型。
分辨率指的是相机可捕捉的细节量，取决于像素大小和视野。在较低的放大倍数下，较小的像素可提供较高的空间分辨率。不过，与较大的像素（如EMCCD相机）相比，信噪比会更低。关键是确定一种像素大小，既能提供足够的分辨率，又能提供良好的信噪比。
速度应当取决于捕获的现象。例如，钙成像就需要尽可能快的帧速率。相机必须足够灵敏，才能快速曝光。当速度是关键考虑因素时，sCMOS或EMCCD相机也许是合适的选择。