显微图像拍摄技巧
发布时间：2020-08-21
显微成像技术一直伴随着显微镜技术的发展，目前已经已经发展到比较成熟的阶段，可以满足各种场景和观测工作的需要，那么在实际的工作中，如何选择和使用好我们的成像系统，就成为我们关注的一个话题，今天我们就来探讨一下显微图像拍摄的几个技巧。
1.选择合适的显微镜
如果只观测样品的荧光是否表达，染色是否成功，只需要在一台荧光体视镜下看一下。当然建议在准备封片之前就通过荧光显微镜检查一下是否染色成功，或者样品周围是否有杂质，确保一切OK后再封片。这样可以节约样本也节约时间。如果需要高质量的成像数据，那么就需要用到共聚焦显微镜了。
如果要拍培养皿，或者做活细胞time series，选择倒置共聚焦显微镜。
如果拍摄载玻片上的样本，正置和倒置的共聚焦显微镜都可以。
如果想拍精细结构，更进一步追求分辨率，可以选用超分辨显微镜。
如果想快速成像，可以选择spinning-disk共聚焦显微镜。
如果想看更深层的样品或者活体成像：双光子显微镜 （confocal: 110um, two-photon:~500um）
如果想高通量，一次设置扫完多张玻璃片：玻片扫描仪
如果想看透明化后的样本，或者整条斑马鱼：光片显微镜
如果想比较不同样品的荧光强度，应该保证拍每一个样品时设置相同的参数。一开始可以大致看一下要比较的几个样品的荧光强度，确定好一个合适的参数，避免用第一个样品的参数拍后续样品出现过曝或者整体太暗等现象。如果是因为染色处理不当造成的不同样品间荧光强度差异很大，建议重新做染色，再重新成像。
Tips：在显微镜的激光或光源刚刚开启时，亮度可能较弱，导致最开始设置的参数不适用于接下来的拍摄，建议等激光或光源稳定后再进行设置。
当然在设置参数时，要找到每个样品的焦平面，也就是在最亮的一层设置，避免在拍z-stack时，个别层过曝。
设置激光强度（intensity）、曝光时间（exposuretime）、增益值（gain/HV）等参数，使得图像的最大荧光强度处于dynamic range的50-75%，不要出现过曝现象，可勾选Range Indicator (Zeiss ZEN软件)模式来判断是否过曝，亮红为过曝，要避免。
3.选择合适的放大倍数和分辨率
依据具体的观测场景选择放大倍数的物镜。总体来说，低倍镜成像视野更大；高倍镜成像视野小，但是分辨率很高。同时注意，在用较高放大倍率物镜拍摄时，需要的激光强度较高，要防止光漂白和光毒性的产生。此外如果想选用高倍镜拍大图拼接也需要考虑时间成本。
4.选择合适格式来存储图片
优先保存一份显微镜厂家格式的图片，因为这里包含了很多拍摄时的参数，方便日后查阅和参考。如果需要进行图像分析和处理，建议导出成无损压缩的PNG,TIFF或GIF格式，这些格式虽然缩小了图片大小，却保存了图像的原始信息。注意避免将图片保存成JPG/JPEG格式，这样会损失图像质量和图像信息，即使再把JPG/JPEG转换成前面提到的格式也无济于事。
5.其他小建议
在做培养皿成像时，要选用玻璃皿底的培养皿，因为普通塑料的折光率和一般用于成像的玻璃不一致，会影响拍摄质量。
在设置z-stack的step interval时，优先选用optimal，这是该镜头在z轴方向的最小分辨率，如果step interval设置的比这还小，就没有意义了。
作为实验研究的成果，图片和视频是非常直观的体现，希望以上的技巧可以帮忙大家获取更好更有效的影像数据。