超分辨成像技术原理及应用

我们知道显微镜的分辨率公式：0.61λ/NA。所以要提高分辨率要从入射光的波长和数值孔径下手。为了提高光学显微镜的分辨率，早期工作主要是在如何减小艾里斑的尺寸，包括减小光的波长、增大数值孔径。

超分辨光学成像技术通常指的是基于远场光学显微镜的超分辨成像技术，主要包括两种实现途径：一种是基于特殊强度分布照明光场的超分辨成像方法（如STED）。另一种是基于单分子成像和定位的方法（如PALM）。
远场光学显微镜（Far-field Optical Microscope），物镜和样本之间的距离远大于光的波长。进一步的研究表明，远场光学显微镜存在分辨率极限的主要原因在于远场一般只能收集传导波信号，而携带了高频信息的倏逝波（Evanescent Wave），其电场强度随传播距离的增加而呈指数衰减。

Q1 :SIM成像系统的推导过程似乎默认光源是相干光源，如果用非相干光源实现SIM，则该系统设计的理论推导过程是否仍相同？
A: SIM的原理是基于相干光源的，但是SIM的原理是不变的，所以推导过程是一致的。相干光源最大的好处是可以通过两个平面波来干涉来得到照明条纹，这个条纹通过对比度得到会有保证，在控制好偏振的时候可以达到0-90%以上的对比度，从而使调制的效果更好。如果是用非相干光的话，它的相干性较弱，调制的对比度会下降，会影响最终的成像效果。

Q2: 可否点评一下SOFI技术？
A: SOFI是通过相关函数计算出来在一个范围内出现的概率情况，这是它本身的特性。它计算相关函数的一个优势是比单分子定位所需要的离散型更弱一点，它可以在一个范围内有多个分子处于亮的状态来计算它们之间的相关函数，理论上成像速度会比单分子定位更快一些。但是劣势是后期的计算量更高，以及相关性的测量需要的信噪比也更高一些。
 
Q3:SIM适合做厚样品的细胞实验么?样品厚的话，离焦信号很强，往往导致原始图像的调制度很低，这个有好的解决办法么
A:  SIM是一种宽场的照明方式，确实对厚细胞样品会带来离焦背景信号的问题。对于厚样品首先取决于标记密度，如果密度较大，会影响调制深度，如果标记密度稀疏的样品也可以用SIM来实现。如果SIM结合光片的照明模式，有可能实现厚样品的良好成像。
 
Q4:TIRF为什么需要更大的功率？怎么理解GI模式能提高信号量，如果样品都分布在膜上TIRF还是GI好？
A: TIRF需要更大的激发功率，因为倏逝波的穿透深度最大只有100-200nm，但在这范围内的光强度并不是均匀分布的，是随着深度的增加强度在不断衰减，并且是呈指数函数衰减的过程所以对于细胞膜上较远的信号如Actin等，就需要更大的激发光功率，因为它在用倏逝波的尾巴的强度做激发。GI不再是全反射，而是接近折射的效果，它在深度上的衰减更接近线性模型，当照射到1um左右的样品上时，照明光强不会造成明显的衰减，所以可以得到更好的信号量。

Q5 :如何利用空间光调制器或者光栅产生结构光，是反射还是透射？
A: 一般选择透射、相位型光栅，它的透射效率最高，但是选择光栅的话需要做平移和旋转等机械操作，会产生时间分辨率的损失；空间光调制器取决于写图像时的相位属性。现在大部分在使用的为空间光调制器，它所用的为反射光。
 
Q6:MINFLUX理论上可以实现，但是您说存在一定困难，具体体现在什么方面？
A: MINFLUX是相对较新的一种技术，对于单分子追踪是个很好的解决方案，但是对于二维或者三维Donate如何进行切换，以及在5nm以下的定位精度，需要更高的稳定性和可靠性。
 
Q7 :细胞骨架的活细胞成像，请问一下Actin Chromobody这类Nanobody对于骨架周转的影响大吗？还有一个就是李老师的图片拍的都非常漂亮，是由在固定方法上做很多改进吗？
A: 在分子层次上会有些区别，但是从观察到的动态特性没有特别大的区别。PPT中展示的都是活细胞，没有做特别的改进或者固定，基本都是铺片方式来做的成像，对于1um以内的厚度都比较适合做TIRF或者GI的二维的超分辨成像。

随着当年追求超高的分辨率，我们得到了很多意想不到的其他收获和思路，都不断的在推进显微镜事业的发展，对微观世界有更清晰的认识。在使用过程中更进一步的细节，请继续关注蔡司的相关报导。